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Seda. Historias pendientes de un hilo. Murcia, siglos X al XXI

Aplicaciones no textiles y biomédicas de la seda

Fibroblastos de ratón creciendo de forma alineada sobre un film de fibroína de seda texturizada con microrranuras

Fibroblastos de ratón creciendo de forma alineada sobre un film de fibroína de seda texturizada con microrranuras

 
Micrografía de barrido de las células creciendo en el entramado poroso de fibroína

Micrografía de barrido de las células creciendo en el entramado poroso de fibroína

 
Micrografía de barrido de una malla electrohilada de fibroína de seda con fibroblastos de piel de ratón creciendo sobre la misma. Este material muestra una estructura análoga a la matriz extracelular

Micrografía de barrido de una malla electrohilada de fibroína de seda con fibroblastos de piel de ratón creciendo sobre la misma. Este material muestra una estructura análoga a la matriz extracelular

 
Micrografías de células PC12 diferenciadas a células neurales creciendo sobre un biomaterial híbrido de fibroína con grafeno, donde se observan las neuritas y conexiones que se establecen entre ellas

Micrografías de células PC12 diferenciadas a células neurales creciendo sobre un biomaterial híbrido de fibroína con grafeno, donde se observan las neuritas y conexiones que se establecen entre ellas

 
Micrografías de células PC12 diferenciadas a células neurales creciendo sobre un biomaterial híbrido de fibroína con grafeno, donde se observan las neuritas y conexiones que se establecen entre ellas.

Micrografías de células PC12 diferenciadas a células neurales creciendo sobre un biomaterial híbrido de fibroína con grafeno, donde se observan las neuritas y conexiones que se establecen entre ellas.

 
Imagen obtenida mediante microscopía confocal de fibroblastos humanos creciendo en cultivo sobre un film de fibroína de seda.

Imagen obtenida mediante microscopía confocal de fibroblastos humanos creciendo en cultivo sobre un film de fibroína de seda.

 
 Nanopartículas de fibroína de seda de diámetro inferior a 100 nm para liberación dirigida de fármacos.

Nanopartículas de fibroína de seda de diámetro inferior a 100 nm para liberación dirigida de fármacos.

 

 José Luis Cenis Anadón 


 

Hay pocas palabras tan evocadoras como la palabra seda. Lo primero que trae a nuestra memoria es un tejido de suavidad y ligereza únicas que asociamos a una idea de calidad y lujo.

El tafetán, el damasco, el brocado, el terciopelo, el satén….

Pero la seda atrae también al historiador y al geógrafo, que la ven como elemento creador de rutas comerciales esenciales que conocemos como la Ruta de la Seda. Atrae también al ingeniero de materiales por su resistencia, superior a la de cualquier otro material orgánico. Al investigador biomédico, por sus recientes aplicaciones en Biomedicina. Y al biólogo, por la variedad de funciones que desempeña.

A pesar de su valor, la seda tiene un origen humilde. Consiste en una secreción proteica producida por algunos insectos y arañas y con funciones biológicas muy diversas. La palabra se suele asociar únicamente con la seda que produce el lepidóptero Bombyx mori, el gusano de la seda. Este insecto produce un único hilo de más de un kilómetro, que se organiza en un capullo, una estructura totalmente cerrada para proteger el proceso de pupación que transcurre en su interior.

Pero hay otras sedas, producidas por hasta 28 géneros de artrópodos, incluyendo algunos tan conocidos como abejas y grillos. Las arañas tejen hasta siete tipos de seda para formar una red que sirve para la predación de sus presas. Los ácaros forman una especie de gasa muy fina que les sirve de protección y en la que desarrollan su ciclo vital. Las crisopas producen un tallo erecto en cuyo extremo fijan los huevos.

Gran parte de la singularidad de la seda reside en el hecho de que esta diversidad de funciones se obtiene a partir de pequeñas variaciones sobre un único diseño molecular.

La proteína fibrosa de la seda, la fibroína, presenta dominios peptídicos repetidos, formados por repeticiones de los aminoácidos Glicina y Alanina que se organizan en una conformación plana conocida como lámina beta. Estos dominios son hidrófobos y cristalinos, confiriéndole a la fibroína una alta resistencia mecánica. A su vez, estos dominios están separados por otros formados por aminoácidos con cadenas laterales largas, que se organizan en hélice o pliegues al azar y que le confieren a la fibroína su gran flexibilidad.

Esta estructura molecular básica, puede presentar variaciones en el número de repeticiones de aminoácidos o en la proporción de dominios cristalinos, adquiriendo así, diferentes características y funciones.

De todas sus propiedades, las más evidentes son la ligereza y la resistencia del material. Ello es lo que le confiere tanto valor como fibra textil. Este uso comenzó con la domesticación del gusano de la seda, en China, hace 5.000 años.

El proceso que llevó a descubrir la utilidad de la seda, domesticar al insecto y desarrollar la tecnología, crear tejidos de extraordinaria belleza, y extenderlos por todo el mundo hasta la actualidad es sin duda uno de los episodios más singulares y fascinantes de la historia de la civilización.

La tecnología de producción de seda entró en Europa a través del Imperio Bizantino en el siglo VI, y a partir de entonces tuvo gran importancia en la economía europea, sobre todo en Italia, Francia y España en los siglos que van del XVII al XIX. Ciudades como Bolonia, Lyon, Valencia, adquirieron gran parte de su riqueza y prestigio con la industria de la seda. Sin embargo, toda la actividad europea se arruinó alrededor de 1850, cuando la enfermedad de la “pebrina” contaminó y provocó la mortandad de casi toda la producción.

Y ahí es cuando entró Murcia en juego. Una vez que Pasteur descubrió el parásito causante de la pebrina y la solución del problema, la industria se pudo recuperar parcialmente, y casi toda la producción española, que era liderada por Valencia, quedó concentrada en Murcia. El proceso fue acompañado por una gran mejora de las técnicas de crianza, una vez que el Ministerio de Fomento estableció la Estación Sericícola de Murcia, en 1892. A partir de ahí, impulsada por el esfuerzo de la ESM, la producción de Murcia se mantuvo, con diversos altibajos hasta 1976. En esa década, la producción europea no pudo hacer frente a la competencia de la seda procedente de China y la actividad cesó. La ESM se reconvirtió en el centro de investigación agraria y agroalimentaria que es ahora el IMIDA, y la actividad de cría del gusano pasó a ser puramente testimonial.

Sin embargo, esta decadencia llevó a explorar nuevos usos y caminos. En este punto hay que decir que el gusano de seda no sirve únicamente para producir fibra textil. La larga convivencia de la cultura china y asiática con el insecto ha llevado a descubrir y valorar otro tipo de aplicaciones que no tienen nada que ver con la seda de uso textil. El gusano sirve para muchas cosas, forma parte de un sistema integral de aprovechamiento. Los excrementos y residuos engordan a los peces en los estanques de las granjas.

Las crisálidas residuales de la hilatura, son nutritivas para los animales. Las larvas que no producen capullos pueden aprovecharse para hacer la fibra de sedal. Pero además, el gusano sirve también como alimento. En zonas de China y Corea, la crisálida del gusano es consumida, cocinada o enlatada. Su contenido proteico y su rendimiento son muy elevados, hasta el punto de haber sido propuesta como alimento en misiones espaciales de larga duración.

Por otra parte, el cuerpo de la larva acumula metabolitos de gran valor biológico procedentes de las hojas de morera que consume. El polvo obtenido de larvas liofilizadas y trituradas presenta buenas propiedades en la reducción de niveles de azúcar en sangre y en la mejora del síndrome metabólico, tal como indica la literatura científica. Se sabe también que los péptidos de la seda son efectivos en el control de diabetes en animales de laboratorio, a través de un efecto protector de células beta pancreáticas. Y hay que mencionar también el amplio uso de las proteínas de la seda en cosmética.

Las fibroína tiene un demostrado efecto cicatrizante y regenerante en las células de la piel. La otra proteína de la seda, la sericina, tiene a su vez un efecto hidratante. Ambas proteínas se incorporan como activos a algunas cremas de alta gama. También se incorporan hidrolizados de seda, donde ésta se presenta descompuesta en péptidos y aminoácidos.

A su vez, el aceite obtenido mediante presión de la crisálida presenta ácidos grasos de reconocida actividad biológica y es también utilizado para el cuidado de la piel.

Dos empresas de Murcia producen y comercializan este aceite. Pero de todas las diversas aplicaciones no textiles, la que sin duda destaca en la actualidad es el uso de la seda como biomaterial en investigación biomédica. Un biomaterial es un material, de origen biológico o químico, que interacciona con tejidos animales para diversos fines, normalmente como prótesis. El desarrollo de nuevos biomateriales ha conocido un decisivo impulso en la última década, a partir del descubrimiento de la existencia y propiedades de las células madre, células indiferenciadas que bajo los estímulos adecuados, se diferencian para formar tipos celulares específicos de los diferentes tejidos y órganos. Este descubrimiento llevó al desarrollo de un nuevo paradigma, la Medicina Regenerativa. A partir de los conocimientos adquiridos acerca de la localización, proliferación y diferenciación de las células madre, se hace factible extraer estas células de un paciente, que pueden proceder de la piel o la grasa, cultivarlas para formar un tejido, y transplantarlo sin riesgo alguno de rechazo al ser células autólogas. Sin embargo, en la reconstrucción de tejidos hay un componente esencial que necesitan las células para formarlos y es un armazón tridimensional (scaffold) sobre el que crecer con la forma adecuada. La búsqueda de biomateriales y configuraciones apropiadas para estas aplicaciones es muy intensa, y se dispone de una gama muy amplia de los mismos, tales como cerámicas, biovidrios, polímeros, etc. Pero de forma tan inesperada como afortunada, una serie de investigaciones realizadas en la Universidad Tufts en Boston, alrededor del cambio de siglo pusieron de manifiesto la gran idoneidad de la fibroína de la seda para fabricar estas estructuras de sostén para el crecimiento de células madre.

A partir de entonces, la evidencia acerca de sus buenas propiedades para esta función no ha dejado de crecer y ha llevado a que la fibroína sea reconocida como uno de los biomateriales más interesantes existentes en la actualidad.

Y en este punto, reaparece el IMIDA, pues a partir de 2006, su Equipo de Biotecnología comenzó una línea de trabajo dedicada al desarrollo de biomateriales de seda para Medicina Regenerativa, en colaboración con muchos grupos de investigación expertos en el campo de la Terapia Celular.

En la década transcurrida, se ha conseguido financiación para consolidar esta investigación, se han obtenido nuevos productos y técnicas y se ha adquirido la infraestructura adecuada para esta tarea. Con ello, tras un paréntesis de 30 años, se ha conseguido dar continuidad a una actividad de investigación sericícola que comenzó en 1892 y cumple por tanto 125 años en 2017.

Propiedades de la seda como biomaterial ¿Cuáles son las propiedades de la fibroína que la hacen tan apta como biomaterial? Una propiedad muy importante es su biocompatibilidad. La implantación de fibroína en los tejidos no provoca rechazo ni inflamación. Ello explica el uso de la seda como sutura quirúrgica desde hace varios siglos hasta la actualidad. La fibroína en los tejidos se va descomponiendo lentamente en péptidos y aminoácidos por la acción de las proteasas. Pero a diferencia de otros biomateriales, en los que los productos de descomposición pueden producir una elevación local de la acidez, los péptidos derivados de la fibroína tienen incluso un efecto bioactivo favorable. Se sabe que dichos péptidos son antiinflamatorios y tienen también un efecto cicatrizante en vivo.

Otra importante cualidad es que los aminoácidos que constituyen la fibroína presentan numerosos grupos químicos reactivos en la superficie del material. Ello permite unir a la fibroína, mediante enlace covalente, una gran diversidad de moléculas y proteínas tales como péptidos de adhesión celular (RGD), factores de crecimiento celular de carácter proteico (BMP-2, bFGF…), anticuerpos, etc. Esta propiedad es fundamental para el éxito de un biomaterial, dado que estos compuestos actúan en la activación de cascadas de señalización en las células que promueven su diferenciación hacia tipos celulares específicos, o favorecen su adhesión y proliferación.

Este diálogo bioquímico entre las células y el biomaterial de soporte es un elemento clave en la ingeniería tisular.

Hay que mencionar también como una gran ventaja de la fibroína su alta resistencia mecánica. Aunque su resistencia a tracción es menor que la de la seda de araña, la seda de Bombyx mori es uno de los biomateriales orgánicos más resistentes que se conocen. Ello lo hace muy adecuado para aplicaciones en las que la resistencia mecánica es un factor relevante, tales como la fabricación de armazones para tejido óseo, cartílago y ligamentos. Además, la tasa de reabsorción de la fibroína es modulable en función de los parámetros de fabricación de los armazones, y en cualquier caso, más lenta que la de los biomateriales orgánicos habituales. Esto permite que las células sembradas tengan tiempo a diferenciarse y organizarse en tejidos antes de que el armazón se reabsorba y desaparezca.

Por último hay que mencionar otra ventaja muy considerable: la seda se produce de forma muy sencilla, barata y escalable.

Casi todo su procesamiento se realiza en medio acuoso sin utilizar reactivos ni disolventes tóxicos.

Presentaciones de biomateriales de fibroína de seda La fibroína admite una enorme diversidad de configuraciones y formatos de uso: films, geles, esponjas tridimensionales, mallas electrohiladas, nanopartículas y fibras. Cada uno de estos formatos, abre el camino a aplicaciones muy diversas.

La fabricación de biomateriales de seda comienza por el vaciado de la crisálida del capullo y el lavado del mismo con una solución de carbonato sódico para eliminar la sericina.

Tras este proceso, obtenemos una masa fibrosa y algodonosa de fibroína pura, que es disuelta mediante una sal de gran fuerza iónica, como el bromuro de litio. Esta solución se dializa para eliminar la sal, con lo que se obtiene una solución acuosa de fibroína que es el punto de partida de la fabricación de todos los formatos de biomateriales.

El material de fibroína más sencillo de fabricar es un film. Se hace vertiendo la cantidad adecuada de fibroína líquida en una superficie plana y dejando evaporar el agua. Se obtiene así una lámina transparente, con la consistencia y el aspecto del celofán. Sobre esta lámina, sumergida en un medio de cultivo adecuado, pueden sembrarse células de diversos tipos que al cabo de varios días acaban confluyendo y formando monocapas equivalentes a un epitelio celular. Este material se está investigando en la actualidad para el desarrollo de córneas en reconstrucción ocular. Dado que la córnea tiene una estructura multilaminar de 200 a 250 láminas de colágeno en la que crecen los queratocitos, la superposición y prensado de láminas de fibroína ultrafinas (2 micras) sembradas con estas células puede imitar dicha estructura nativa.

Un segundo material que se puede fabricar son las esponjas tridimensionales: En esta modalidad, se mezcla la solución de fibroína con un porógeno, típicamente, cloruro sódico de una granulometría de 800 micras. La solución se vierte en un molde, se deja secar, se insolubiliza la fibroína mediante su inmersión en metanol, y se lava la sal. De esta forma, se obtiene una estructura sólida de fibroína pura, con la textura de una esponja. Los poros, conectados entre sí, permiten un buen desarrollo de las células, con un flujo adecuado de nutrientes. Estas estructuras son especialmente adecuadas para reparación de tejido óseo. En modelos animales se han implantado estas esponjas, previamente premineralizadas con hidroxiapatito, y sembradas con células mesenquimales de la médula ósea. Las células se diferencian a osteoblastos, y a medida que estos crecen y generan tejido óseo, la fibroína de la esponja se va reabsorbiendo. Los resultados obtenidos al cabo de un año en modelos animales, son equivalentes a los obtenidos con el injerto de hueso autólogo.

En tercer lugar podemos describir la elaboración de la fibroína en forma de mallas obtenidas mediante electrohilatura (electrospinning). Esta técnica consiste en la proyección de un chorro de polímero, en este caso la fibroína, en un campo eléctrico de decenas de kilovoltios. El intenso campo eléctrico ejerce una fuerza de tracción sobre el chorro de polímero y esto lo adelgaza hasta producir filamentos de cientos de nanómetros (millonésimas de milímetro) de grosor que se agregan y recogen como un fieltro con el aspecto de una hoja de papel en una placa colectora situada bajo el inyector.

El proceso termina por producir una estructura bidimensional, con el aspecto de un papel que se ve al microscopio como un fieltro o malla de fibras ultrafinas desordenadas.

Esta estructura es muy similar a la que presenta la matriz extracelular del tejido conectivo, que sirve como soporte para la fijación y el crecimiento de las células y se compone de diversos tipos de colágeno. Debido a esta similitud con la matriz extracelular, las células de diversos tipos sembradas en esta estructura encuentran un medio muy favorable para su diferenciación y proliferación. Este tipo de armazón por su configuración bidimensional, se está investigando ampliamente para la reparación de piel en casos de úlceras y quemaduras mediante siembra y cultivo en el mismo de quOtra posibilidad que ofrece la fibroína es la fabricación de nanopartículas, es decir, de diámetro menor de 100 nanómetros.

Estas partículas pueden unirse a fármacos de muchas clases, y también a moléculas y anticuerpos que permiten direccionar las partículas con su carga a tejidos específicos. De esta forma se consigue una aplicación de fármacos mucho más localizada y lenta, reduciendo los efectos secundarios de una aplicación sistémica. La fibroína se presta especialmente bien a la fabricación de nanopartículas, debido a las peculiaridades de su estructura molecular. En presencia de ciertos disolventes, la cadena de aminoácidos se pliega espontáneamente, obteniéndose unas partículas de 100 nanómetros de diámetro que pueden cargarse con diversos fármacos y proteínas de forma covalente y permitiendo posteriormente su liberación progresiva. En el IMIDA, trabajando en colaboración con las Universidades de Murcia, Granada y Zaragoza, se han desarrollado este tipo de partículas mediante el uso como disolvente de líquidos iónicos.

Se han ensayado en modelos animales y celulares, con buenos resultados, para la liberación de antiinflamatorios de origen vegetal en la terapia de colitis ulcerosa y la liberación de compuestos citotóxicos para células tumorales.

Hay que mencionar también el uso de fibras de seda para la formación de armazones destinados a trabajar en condiciones de tensión mecánica. Un ejemplo muy claro lo constituye la fabricación de estructuras para formar armazones para ligamentos y tendones. En este caso, se realiza un trenzado con fibras de fibroína nativas, no disueltas, y dicho trenzado se siembra con fibroblastos que al cabo del tiempo crecen y reabsorben la fibroína formando un sustituto de ligamentos.

Como se deduce de lo expuesto, la fibroína de la seda ofrece una versatilidad extraordinaria en la fabricación de diversas estructuras para sostener el proceso de formación de tejidos a partir de su siembra con células. Pero además, la fibroína presenta la gran ventaja de ser un material biológico, una proteína. Ello nos permite la utilización de todo el conjunto de herramientas biotecnológicas para modificar sus propiedades en función de los diferentes usos que sean necesarios.

Dado que el gen de la fibroína está identificado y clonado, es posible producir fibroína recombinante en un sistema de expresión fermentativo, y también producir fibroína quimérica en la cual la combinamos con otras proteínas, por ejemplo, elastina. Dada esta posibilidad de diseñar y expresar proteínas de fusión con fibroína, la posibilidad de producir materiales con nuevas funciones y propiedades es ilimitada. Esta extremada versatilidad y la combinación única de resistencia y biocompatibilidad no la presenta ningún otro biomaterial conocido, lo que permite imaginar un enorme desarrollo de futuras aplicaciones de los biomateriales de seda en el campo de la Medicina Regenerativa. Y estas aplicaciones, aseguran un desarrollo futuro de la actividad sericícola. No deja de ser extraordinario que un material desarrollado hace cinco milenios se proyecte de esta forma hacia el futuro, dándole un nuevo giro a la belleza y la fascinación de la seda.eratinocitos de la piel autólogos.

 

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